ОБЗОРЫ

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА АНТИФОСФОЛИПИДНОГО СИНДРОМА

Е.Н.Александрова, A.A. Новиков, Д. С. Новикова ГУ Институт ревматологии РАМН, Москва

Антитела к фосфолипидам (аФЛ) - семейство аутоантител, распознающих антигенные детерминанты анионных и нейтральных фосфолипидов (ФЛ) и комплексные эпитопы. образующиеся в процессе взаимодействия ФЛ и фос-фолипидсвязывающих белков плазмы крови |1]. Гиперпродукция аФЛ ассоциируется с развитием антифосфолипид-ного синдрома (АФС), к клиническим проявлениям которого относятся рецидивирующие венозные и артериальные тромбозы, привычное невынашивание беременности и тромбоцитопеиия [2,3,4]. Выделяют первичный АФС (ПАФС) и вторичный АФС (ВАФС), связанный с системной красной волчанкой (СКВ) и другими аутоиммунными заболеваниями, а также с инфекциями, злокачественными новобразованиями и приемом лекарственных препаратов [3]. Основными методами лабораторной диагностики АФС являются обнаружение волчаночного антикоагулянта (ВА) с помощью фосфолипидзависимых коагуляционных тестов и определение р2-глнкопротеин -! (р2'ГШ)-зависимых антител к кардиолипину (аКЛ) класса IgG и IgM стандартным иммуноферментным методом (ИФМ) [5-12]. Вместе с тем, стандартные методы исследования ВА и аКЛ не позволяют выявить весь спектр аФЛ, ассоциирующихся с различными клиническими проявлениями АФС. При наличии у пациентов характерных клинических признаков АФС и низкоположительных или отрицательных результатов тестирования ВА и аКЛ целесообразно использовать дополнительные лабораторные методы для постановки диагноза АФС, в первую очередь, определение антител к р2-ГП 1 (ар2-ГП1), реже - IgA аКЛ и антител к другим ФЛ (фосфатидилино-зитолу - ФИ, фосфатидилсерину - ФС, фосфатидилэтано-ламину -ФЭ, фосфатидилхолину - ФХ, смеси ФЛ) и фос-фолипидсвязываюшим белкам (протромбину, аннексину V и др.) [13|. Методы идентификации ВА представлены в обзоре З.С.Баркагана и соавт. [14]. Целью настоящего исследования являлось изучение диагностической точности и методических аспектов иммуноферментного анализа аФЛ.

Результаты количественного определения аКЛ с помощью ИФМ не соответствует закону нормального распределения, что затрудняет использование параметрических тестов при интерпретации полученных данных. Для улучшения воспроизводимости и межлабораторной сопоставимости результатов рекомендуется оценка концентрации IgG- и IgM-аКЛ в международных единицах GPL и MPLc использованием стандартных сывороток, предоставлявших лабораторией по стандартизации аФЛ (Louisville). Имеются также стандарты для количественного определения IgA-аКЛ [13]. Одна единица GPL соответствует фосфолипидсвязы-вающей активности I мкг/мл IgG-аКЛ, а одна единица MPL- I мкг/мл IgM-аКЛ, очищенных методом афинной хроматографии. Пересчет показателей ОП исследуемых сывороток в единицы концентрации GPL и MPL осуществляется с помощью построения калибровочной кривой зависимости логарифма ОП стандарта от логарифма концентрации аКЛ, представленной уравнением линейной регрессии [15]. По данным литературы верхняя граница нормальной концентрации IgG-aKJl в сыворотке крови составляет от 7,0 до 23,0 GPL, IgM-аКЛ - от 6,0 до 15,0 MPL [16]. Со-

Адрес: 115522 Москва, Каширское ш„ 34а ГУ Институт ревматологии РАМН. Тел.:115-93-77

гласно международным рекомендациям при интерпретации результатов следует использовать не абсолютные значения уровня аКЛ в СР1_/МРЬ, а уровень позитивности |15| (табл.1).

Таблица I

ГРАНИЦЫ СТЕПЕНЕЙ ПОЗИТИВНОСТИ ПРИ ОЦЕНКЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ аКЛ

Степень позитивности Класс аКЛ

IgG аКЛ (GPL) IgM аКЛ (MPL)

Высокопозитивные > 65 > 45

Умереннопознтиввые 30-65 35-45

Низкопозитивные 23-30 26-35

Негативные < 23 < 26

С позиций доказательной медицины оптимальный подход к анализу диагностической точности ИФМ определения аФЛ связан с использованием характеристических кривых (ROC-curve - receiver-operator characteristic curve) [17, 18, 19]. При построении графика ROC-кривых по оси абсцисс откладывают частоту ложноположительных результатов (1-специфичность) (%), а по оси ординат - частоту истинноположительных результатов (чувствительность) (%). Значения чувствительности и соответствующие им доли ложноположительных результатов определения аФЛ, рассчитанные по всему диапазону точек разделения между нормой и патологией, наносятся на плоскость и соединяются плавной линией. Точка, наиболее близкая к перегибу графика, рассматривается как оптимальное соотношение чувствительности и специфичности. Выбор точки разделения делается с учетом соотношения ложноположительных и ложноотрицательных результатов. Универсальным методом анализа ROC-кривых является оценка площади под кривой (area under curve - AUC), изменяющейся от 0,5 (отсутствие диагностической эффективности теста) до 1,0 (максимальная эффективность теста).

Нами изучена диагностическая точность ИФМ определения аКЛ и ар2-ГП1 у 170 больных, включая 41 больного с ПАФС, 50 больных с ВАФС (СКВ с АФС) и 79 больных с СКВ при уровнях позитив^^ти, установленных по верхней границе нормы у 100 зд^Ивых лиц [20]. и с использованием ROC-кривых. Анализ значений аФЛ относительно верхней границы нормы показал, что IgG ар2-ГП1 в целом более чувствительный и специфичный маркер АФС и тромбозов, чем IgG и IgM аКЛ. По результатам ROC- анализа при использовании оптимальных “cut off" значений аФЛ, ассоциирующихся с диагнозом АФС. IgG ар2-ГПI являлись более специфичным, но менее чувствительным маркером АФС по сравнению с IgG и IgM аКЛ (табл. 2). Относительно тромбозов IgG аКЛ и IgG afîi-ГПI проявляли сходную чувствительность (53-54%) и специфичность (84-85%), значительно превосходя по уровню специфичности IgM аКЛ (64,6%). При этом оптимальный уровень позитивности IgG аКЛ, ассоциирующийся с развитием тромботических осложнений (33,2 GPL), оказался выше, чем

Таблица 2

ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ТОЧНОСТЬ ИФМ ОПРЕДЕЛЕНИЯ аФЛ ОТНОСИТЕЛЬНО АФС

Тип аФЛ IgG аКЛ IgM aKJI IgG ар2-ГП!

АНАЛИЗ ПО ВЕРХНЕЙ ГРАНИЦЕ НОРМЫ

"Cut-оГГ 23,0 GPL 26,0 MPL 9,3 ед/мл

Чувствительность, % 57,1 69,1 60,0

Специфичность, % 73,5 80,9 83,8

АНАЛИЗ ПО ROC- КРИВЫМ

"Cut-ofT 18,1 GPL 7,8 MPL 11,2 ед/мл

Чувствительность, % 62,4 67,8 56,2

Специфичность, % 71,4 72,3 85.9

AUC 0,763; 0,704; 0,821;

(ДИ 95%) 0,691-0,835 0,620-0,789 0,758-0,884

Таблица J

ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ТОЧНОСГЬ ИФМ ОПРЕДЕЛЕНИЯ аФЛ ОТНОСИТЕЛЬНО ТРОМБОЗОВ

Тип аФЛ IgG аКЛ IgM аКЛ IgG ap2-mi

АНАЛИЗ ПО ВЕРХНЕЙ ГРАНИЦЕ НОРМЫ

"Cut-оГГ' 23,0 G PL 26,0 MPL 9,3 ед/мл

Чувствительность, % 54,5 58,6 58,1

Специфичность, % 72,7 77,0 84,6

OR 4.21 1,49 4,80

(ДИ 95%) (2,20-8,10) (0,37-2,86) (1,48-5,43)

АНАЛИЗ ПО ROC- КРИВЫМ

"Cut-ofT' 33,2 GPL 8,0 MPL 13,4 ед/мл

Чувствительность, % 53,3 61,0 53,8

Специфичность, % 84,8 64,6 83,8

AUC 0,729; 0,617; 0,779;

(ДИ 95%) 0.650-0.808 0,527-0.708 0,708-0,851

OR 6,42 2,83 5,60

(ДИ 95%) (3,10-13,35) (1,48-5,43) (2,69-11,61)

OR (odds raiio) - отношение шансов.

для диагностики АФС (18,1 GPL) (табл.З). AUC у IgG ар2-ГП1 при АФС и тромбозах была больше, чем у IgG и IgM аКЛ (табл. 2 и 3; рис. I и 2). Таким образом, анализ ROC-кривых свидетельствует о большей диагностической эффективности определения ар2-ГП I при АФС по сравнению с аКЛ. Прогностическое значение положительных результатов тестирования аФЛ относительно тромбозов (OR) было выше при "cut оЛУ' вычисленных с помошью ROC-кривых (табл.2). Положительные результаты тестирования IgG аКЛ и IgG aPj-ГП I, в отличие от IgM аКЛ, ассоциировались с высоким риском развития тромботических осложнений, при этом наиболее эффективным тестом для прогнозирования тромбозов являлось определение IgG аКЛ.

Результаты нашего исследования хорошо согласуются с материалами других авторов. По данным литературы чувствительность ИФМ определения аКЛ для диагностики АФС составляет 30 -87%, специфичность - 54-86%. Тестирование ар2-ГП1 в сыворотках больных АФС имеет большую специфичность (88-96%) и меньшую чувствительность (32-62%) по сравнению с аКЛ [21 - 26]. Наиболее высокие показатели чувствительности (83%) и специфичности (99%) ар2-ГП1 получены J.Guerin и соавт. [21]. J.-C.Wnsmuth и соавт. [ 18] применяли анализ ROC-кривых у 144 больных с подозрением на АФС при изучении диагностической точности 23 коммерческих тест-систем для определения аКЛ и а|Ь-ГП1. Диагностическая точность большинства методов определения аКЛ и ар2~ ГПI изотипов IgG и IgM возрастала по мере увеличения числа клинических критериев, использовавшихся для постановки диагноза АФС. В том случае, когда диагноз АФС базировался на двух или трех типичных клинических признаках, чувствительность тестирования

аКЛ и ар2-ГП1 составляла не более 67%, AUC - от 0,60 до

0,72. Наиболее высокая диагностическая точность методов определения аКЛ и ар2-ГП1 наблюдалась при наличии четырех и более клинических критериев АФС (чувствительность до 100%, AUC более 0,8), что связано с уменьшением числа ложноотрнцательных результатов. По данным J.M. Musial и соавт. [19], анализ характеристических кривых позволяет установить оптимальные "сш-ofF' значения аФЛ, связанные с основными клиническими симптомами АФС. При исследовании клинического значения аФЛ у 204 больных АФС положительные результаты тестирования ВА ассоциировались с высоким риском развития тромбозов (OR: 3,04; 1,5-6,2; доверительный интервал-ДИ 95%) и повторными потерями плода (OR: 8,7; 2,8-26,7; ДИ- 95%). Анализ ROC кривых показал, что для прогнозирования тромбозов наиболее точным тестом является исследование IgG аКЛ ("cut-ofT>l7,2 GPL; OR: 3,69; 1,8-7,4; ДИ- 95%); повторных потерь плода- IgG аФИ.(''сш-о(Г>22,1 ед.; OR: 6,21; 2,1-18,5; ДИ- 95%), IgG аКЛ и IgG аЬ2-ГП1; тромбо-цитопении - IgM аФС ("cut-olT'>6,7 ед.; OR: 1,9; 1,04-3,4; ДИ-95%). При этом у 6,6% больных с клиническими признаками АФС и негативными результатами тестирования на ВА и аКЛ обнаружены другие субтипы аФЛ, главным образом IgM аФИ. Популяционные исследования предсказательной ценности положительных результатов нммуно-ферментного анализа аКЛ и ар2-ГП1 для диагностики АФС показали, что аКЛ в целом имеют низкую чувствительность и специфичность, а ар2-ГП1 - низкую чувствительность, но высокую специфичность относительно вероятности возникновения тромбозов при АФС [12].

Различия результатов изучения чувствительности и сие-

Рисунок I

ROC-КРИВЫЕ ДЛЯ ИФМ ОПРЕДЕЛЕНИЯ аФЛ ОТНОСИТЕЛЬНО АФС

............IgG аКЛ

------------IgM аКЛ

■■ — - ■ ■ IgG ар2-ГП1

По оси ординат - чувствительность

По оси абсцисс - 1-специфичность

цифичности аФЛ при АФС могут зависеть от выбранного уровня позитивности, подбора больных АФС и методических особенностей определения аФЛ.

В настоящее время предложено большое количество "home made" методик и коммерческих тест-систем для им-муноферментного анализа аКЛ. Несмотря на стандартизацию основных методических аспектов ИФМ определения аКЛ, полученные результаты нередко носят противоречивый характер. Так, поданным многоцентрового исследования частота обнаружения аКЛ в популяции при использовании 9 различных коммерческих тест-систем варьировала от 31% до 60% для IgG аКЛ и от 6% до 50% для IgM аКЛ; при этом наклон графика линейной регрессионной зависимости результатов измерения концентрации аКЛ в едени-цах GPL и MPL с помощью стандартов, предоставленных лабораторией по стандартизации аФЛ, и калибраторов тест-систем составлял, 0,159-0,93 для IgG аКЛ и 0,236-0,836 для IgM аКЛ [27]. Имеются также данные о более высокой вариабельности операционных характеристик шести коммерческих и одной "in-house" тест-систем для определения IgG - и IgM аКЛ по сравнению с пятью коммерческими тест-системами на IgG- и IgM ар2-ГП1 [28]. Хорошая воспроизводимость результатов в значительной степени зависит от четкого выполнения ряда рекомендаций, разработанных для иммуноферментного анализа аКЛ. Перед внесением в лунки полистироловых микроплат КЛ растворяют в этаноле либо в смеси этанола и хлороформа. Для иммобилизации КЛ на твердой фазе лунки планшета высушивают под вакуумом, либо в течение 18 часов при 4°С. Предотвращение липидного окисления с помощью азота на данном этапе является спорным вопросом, так как окисление КЛ в целом способствует увеличению его отрицательного заряда и связывающей активности. Ранее интенсивно изучалась возможность использования в тест-системах для иммуноферментного анализа аФЛ помимо КЛ других ФЛ, включая ФИ, ФС, ФЭ, ФХ и различные смеси ФЛ [29]. Полагают, что обнаружение различных субтипов аФЛ при

Рисунок 2

ROC-КРИВЫЕ ДЛЯ ИФМ ОПРЕДЕЛЕНИЯ аФЛ ОТНОСИТЕЛЬНО ТРОМБОЗОВ

...........IgG аКЛ

-----------IgM аКЛ

-----------IgG ар2-ГП!

По оси ординат - чувствительность По оси абсцисс - I-специфичность

АФС в основном определяется степенью их связывания с р2-ГП1 и не зависит от специфического взаимодействия с отдельными ФЛ, за исключением реагирования антител с ФЭ [301. E.N.Harris и S.S.Pierangeli [13] предложили наряду с исследованием ар2-ГП1 определять антитела к смеси ФЛ с помощью разработанной ими тест-системы "APhL ELISA kit" для диагностики "сомнительного" АФС у больных с отрицательными результатами тестирования аКЛ и ВА или с низкими титрами аКЛ. Однако данный метод не нашел подтверждения в работах H.M.Day и соавт. (26]. Блокирование участков неспецифического связывания обычно проводится с помощью 10% раствора фетальной телячьей или бычьей сыворотки в фосфатно-солевом буфере в качестве источника кофактора р2-ГП1, который связывается с иммобилизированным на твердой фазе КЛ и частично - со свободными участками на поверхности микроплат. Следует подчеркнуть, что любые методические различим, касающиеся концентрации бычьей сыворотки, разведения и объема проб в лунке, свойств КЛ (окисление, степень очистки), могут приводить к изменению связывающей активности р2-ГП1 и результатов определения аКЛ. При измерении соотношения р2-ГП1 - зависимых и р2-ГП1 - независимых субфракций аКЛ до и после внесения в тест-систему экзогенного Р2-ГП1 используется буферный раствор с добавлением бычьего сывороточного альбумина или желатина [31]. Тестируемые сыворотки разводятся блокирующим буферным раствором, содержащим не только р2-ГП1, но и другие белки сыворотки быка. Кроме того, в образцах исследуемых сывороток может присутствовать и собственный р2-ГП! человека. В связи с этим при определении аКЛ в сыворотке крови рекомендуется вычитать ОП лунки без КЛ из ОП лунки с КЛ. В сыворотках больных могут выявляться не только аКЛ и р2-ГП1, но и низкоаффинные антитела к протромбину, белкам С и S [32] и кининогену [33|, что в целом снижает чувствительность ИФМ определения

аКЛ. Для определения IgG-, IgM- и lgA-аКЛ используют изотипспецифические антитела к иммуноглобулинам человека, меченные пероксидами. Показано, что(в отличие от IgG- и IgM-аКЛ уровень IgA-аКЛ слабо коррелирует с клиническими проявлениях АФС |34|. По данным литературы высокая частота обнаружения IgM-аКЛ в низких титрах может быть связала с увеличением концентрации поликлонального IgM [35|, а также наличием IgM-ревматоидного фактора [36| в тестируемых сыворотках. При определении аКЛ с помощью ИФМ не рекомендуется предварительное прогревание сывороток, приводящее к конвертации аКЛ-отрииательиых образцов в аКЛ-положнтельные, в том числе и у здоровых лиц [37, 38). Несмотря на предположение, согласно которому использование в тест-системе для нмму-ноферментного анализа аКЛ 0.05% буферного раствора детергента Tween 20 позволяет отличить (Ь-ГПI - зависимые от р2-ГП1 - независимых аКЛ |39|, имеются данные, что Tween 20 может полностью блокировать связывание Ь2-ГП1 с КЛ 1401, а также удалять КЛ со дна лунок при отмывках 141).

Одной из наиболее сложных проблем лабораторной диагностики АФС является недостаточно высокая специфичность аКЛ, что в ряде случаев может приводить к ложноположительной диагностике АФС и неоправданному назначению антикоагулянтов. Улучшение диагностики АФС связано с необходимостью определения afb-ГП I, обладающих большей специфичностью в отношении диагноза АФС. При внесении очищенных антител больных в тест-систему для иммуноферменгного анализа аКЛ без добавления фетальной сыворотки было показано, что^-ГП I является кофактором, обязательным для специфического связывания "аутоиммунных" аКЛ, ассоциирующихся с АФС, но подавляющим связывающую активность "инфекционных" аКЛ |31,42|. Содержание р2-ГП1 в иммуноферментном тесте, соответствующее оптимальному связыванию аКЛ, составляет 8 мкг/мл и более; при концентрации р2-ГП1 менее I мкг/мл связывающая активность аКЛ падает до нуля |8|.В сыворотке человека р2-ГП1 присутствует в концентрации около 200 мкг/мл, в то время как в бычьей сыворотке его уровень в 2-3 раза выше |43]. Большинство, но не все субтипы аКЛ человека связываются с бычьим |Ь-ГП1 [44,45]. Количеству аКЛ в тестируемой сыворотке, разведенной 1:100 в 10% растворе фетальной сыворотки, соответствует адекватный для оптимального связывания уровень р2-ГПГ, использование блокирующего и разводящего раствора без добавления фетальной сыворотки, содержащей экзогенный Р2-ГП1, приводит к значительному снижению связывающей активности аКЛ |43]. Прямое тестирование р2-ГП1 с помощью ИФМ относительно иммобилизированного на твердой фазе аффинноочншенного р2-ГП1 пока недостаточно стандартизировано на международном уровне. При этом для иммуноферментиого анализа р2-ГП1 в основном применяются "высокосвязывающие" полнетироловые микроплаты, подвергнутые рентгеновскому облучению |46|. Противоречивость результатов определения р2-ГП1 в многом связана с методическими различиями при проведении иммунофер-ментного анализа. В ряде случаев коммерческие препараты Р2-ГП1 могут подвергаться частичному расщеплению на уровне фрагмента Lys 317-Thr 318, находящегося рядом с фосфолипилсвязывающим сайтом Cys 281-Cys 288 V домена, что приводит к существенной потере функциональной активности р2-ГП1 [47]. Наряду с этим обнаружена способность плазмина и фактора Ха расшеплять данный фосфо-липидсвязывающий участок р2-ГП1 |48|. Ь2-ГП1 - гетерогенная группа аутоантител, включающая, главным образом, низкоафинные антитела, которые проявляют функциональную активность при условии бивалентного связывания и высокой плотности антигена, иммобилизированного на по-

верхности облученных микроплат [49]. Вместе с тем имеется небольшое количество высокоафииных антител, взаимодействующих с человеческим или бычьим р2-ГП1, адсорбированным на необработанных микроплатах |5|. Поданным R.A.S.Roubey и соавт. [49] связывающая активность Ь2-ГП1 человека проявляется при концентрации р2-ГП1 от I до 5 мкг/мл, в то время как J.Guerin и соавт. [21| использовали концентрацию р2-ГП1 в 20 раз выше. По мнению T.Koike н E.Maisuura [51] высокоафинные мышиные моноклональные антитела одинаково эффективно связываются с Ь2-ГП1, адсорбированным на поверхности необработанных и облученных мнкроплат, а ар2-ГП1 человека не взаимодействуют с р2-ГП1, покрывающим лунки необработанных микроплат. Для эффективного связывания с антителами важное значение имеют распределение и плотность р2-ГП1 на твердой фазе, обеспечивающие оптимальное расстояние и корректную пространственную ориентировку каждого его эпитопа относительно молекул а|Ь-ГП1. Показано, что ди-меризация р2-ГП1 индуцирует выраженное повышение афинности поликлональных ар2-ГП1 у больных АФС, при этом Fab' фрагменты а|Ь-ГП1 не реагируют с нативным и димеризованным р2-ГП1 |49,52[. С другой стороны, нельзя исключить экспрессию ранее скрытых эпитопов р2-ГП1 в результате конформационных изменений, индуцированных связыванием с ар2-ГП1 |51]. Результаты иммуноферментно-го анализа ар2-ГП1 могут варьировать в зависимости от типа буферного раствора, применяемого для нанесения антигена на поверхность микроплат. При разведении р2-ГП1 карбонатным буфером наблюдается более высокая чувствительность определения ар2-ГП1, чем при использовании Трис-буфера [52]. Выявление низкого и нсспецифическо-го связывания ар2-ГП1 обусловлено реагированием антител больных АФС не только с ФЛ и р2-ГП1, но и с широким спектром белков (протромбин, аннексии V, белок С, белок S), потенциально присутствующих в тестируемых сыворотках и связывающихся с незаблокированными участками на дне лунок. Однако в целом данная проблема имеет большее значение для иммуноферменгного анализа аКЛ, при котором указанные сывороточные факторы могут содержаться как в исследуемых сыворотках, так и в фетальной бычьей сыворотке. Наряду с этим связывающая активность a|V ГП1 зависит от количества и продолжительности отмывок, так как каждый цикл отмывки может приводить к кумулятивному снижению числа связавшихся низкоафиииых ар2-ГПI и обшему уменьшению чувствительности ИФМ определения ар2-ГП1.

Таким образом, лабораторная диагностика АФС должна основываться на определении аФЛ в сыворотке крови с обязательным использованием комплекса методов, включая иммуноферментный анализ аКЛ и ар2-ГП1 и исследование ВА с помощью коагулологических тестов. аКЛ-чув-ствигельный, но неспецифический маркер АФС, сильно вариирующий из-за низкой межлабораторной сопоставимости результатов и различий в используемых тест-системах. Наличие у больных АФС ассоциации между повышением уровня аКЛ и увеличением риска развития тромбозов не исключает значения низкопозитивных, ложноположительных результатов тестирования аКЛ как потенциальных тромбогенпых факторов при атеросклерозе и других заболеваниях, не связанных с АФС. Предсказательная ценность положительных результатов исследования а|Ь-ГП1 для постановки диагноза АФС выше, чем у аКЛ и ВА, однако при широком использовании ар2-ГП1 в качестве лабораторного критерия диагностики АФС необходима дальнейшая стандартизация ИФМ определения данного показателя на международном уровне.

ЛИТЕРАТУРА

1. Roubey R.A.S. Immunology of the anliphospholipid antibody syndrome. Arthr. Rheum., 1996, 39, 1444-1454

2. Hughes G.R.V. The antiphospholipid syndrome: ten years

on. Lancet, 1993. 342. 341-344

V Насонов Е.Л. Антмфосфолмпидный синдром. М., Лит-re pa, 2004

4. Калашникова Л.А. Неврология антифоефолипидного

синдрома. М., Медицина, 2003

5. Harris E.N. The Second International Anticardiolipin Standartization Workshop/The Kingston Antiphospholipid Study (KAPS) Group.Am.J.Clin.Pathol., 1990. 94. 476-484

6. Galli М., Comfurius P., Maassen C. el aL Anticardiolipin antibodies (АСА) directed not to cardiolipin but to a plasma protein cofactor. Lancet, 1990, 335, 1544-1547

7. Matsuura E,, Igarashi Y., Fugimoto М., et at. Anticardiolipin cofactor(s) and different diagnosis of autoimmune disease. Lancet, 1990, 336, 177-178

8. McNeil H.P., Simpson R.J.. Chesterman C.N., Krilis S.A.

Antiphospholipid antibodies are directed against a complex antigen that includes a lipid-binding inhibitor of coagulation: B2-glycoprotein I (apoliprotein H).

Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 1990, 87, 4120-4124

9. Brandt J.T.. Triplett D.A., Alving B., Scharrer t. Criteria for the diagnosis of lupus anticoagulants: an update. Thromb.Haemost., 1995, 74, 1185-1190.

10. Pierangeli S.S., Stewart М., Silva L.K., Harris E.N. An

antiphospholipid wet workshop: 7th International

Svmposium on Antiphospholipid Antibodies. J.Rheumathol., 1998, 25, 156-160

11. Wilson W.A., Gharavi A.E.. Koike T. et al. International consensus statement on preliminary classification criteria for definite antiphospholipid syndrome. Arthr. Rheum., 1999, 42. 1309-1311

12. Reddel S.W., Krilis S.A. Testing for and clinical significance of anticardiolipin antibodies.

Clin.Diagn.Lab.Immunol., 1999, 6, 775-782

13. Harris E.N., Pierangeli S.S. "Equivocal" antiphospholipid syndrome. J.Autoimmunity, 2000, 15, 81-85

14. Баркаган З.Г., МомотА.П., Цывкииа Л.П., и др. Принципы лабораторной диагностики антифоефолипидного синдрома. Клинлаб.диагностика. 2000, 3. 47-51

15. Александрова Е.Н., Насонов Е.Л., Ковалев В.Ю. Коли-

чественный иммуноферментный метод определения антител к кардиолипину в сыворотке крови. Клин.рев-матол., 1995, 4, 35-39

16. Tincani A., Balestrieri G., Allegri F. et al. Overview on anticardiolipin

ELISA standartization. J.Autoimmunity, 2000, 15, 195-197

17. Escalante A.. Brey R.L., Mitchell B.D. et al. Accuracy of anticardiolipin antibodies in identifying a history of thrombosis among patients with systemic lupus erythematosus. Am..I.Med., 1995,98, 559-565

18. Wasmuth J.C., Minarro D.O., Homrighausen A. et al. Phoshpholipid autoantibodies and the antiphospholipid antibody syndrome: diagnostic accuracy of 23 methods studied by variation in ROC curves with number of clinical manifestations. Clin.Chem.. 2002.48.1004-1010

19. Musial J., Swadzba J., Motyl A. et al. Clinical significance of antiphospholipid protein antibodies. Receiver operating characteristics plot analysis. J.Rheumatol., 2003,30,723-730

20. Александрова E.H., Новиков A.A., Решетняк T.M. и со-

авт. Антитела к Ь2-гликопротенну-1 и антитела к кар диолипину при антифосфолипидном синдроме: анализ чувствительности и специфичности. Клин.мед.. 2003,9,25-31

21. Guerin J., Feighery С., Sim R.B. et al. Antibodies to B2-glycoprotein-l A specific marker for the antiphospholipid syndrome. Clin.Exp.Immunol.. 1997,109.304-309

22. Delkova D., Gil-Aquado A., Lavilla P. et al. Do antibodies to ?2-glycoprotein I contribute to the better eharacteriza

lion of the antiphospholipid syndrome ? Lupus, 1999,8.430438

23. Amengual O., Atsumi T., Khamashta M.A. et al. Specificity

of ELISA for antibody to B2-glycoprotein 1 in patients wilh antiphospholipid syndrome. Br.J.Rheumatol., 1996,35.1239-1243

24. Horbach D.A., Oort E.V., Donders R.C.J.M. Lupus anticoagulant is the strongest risk factor for both venous and artherial thrombosisi in patients wich systemic lupus erythematosus. Tromb.Haemost., 1996,76.916-924

25. Roubey R. A. S., Maldonado M.A., Byrd S.N. Comparison of an enzimelinked immunosorbent assay for antibodies to ?2-glycoprotein I and a conventional anticardiolipin immunoassay. Arthr. Rheum.,1996,39.1606-16072

26. Day H.M., Thiagarajan P., Ahn.C. et al. Antibodies to B2-glycoprotein I in systemic lupus erylhehematosus and primary antiphospholipid syndrome: clinical correlations in comparison with other antiphospholipid antibody tests. J. Rheumatol.. 1998,25,667-674

27. Reber G.. Arvieux J., Comby E. el al. Multicenter evalua-

tion of nine commercial kits for the quantitation of anticardiolipin antibodies. The working group on methodologies in haemostasis from the GEHT (groupe d'Etudes sur le hemostasis et la thrombose).

Thromb.Haemost., 1995,73,444-452

28. Andrian M.A., Colonna F., Morio F. et al. Comparison of different kits in the detection of auioantibodies to cardiolipin and beta2 glycoprotein I. Rheumatol. (Oxford), 2004,43,181-185

29. McNeil H.P., Chesterman C.N., Krilis S.A. el al. Immunology and clinical importance of anliphospholipid antibodies. Adv.lmmunol., 1991,49,193-280

30. Boffa M.C., Berard M., Sugi T. et al. Antiphosphatidulethanolamine antibodies as the only antiphospholipid antibodies detected by ELISA II Kininigen reactivity. J.Rheumatol.,1996,23,1375-1379

31. Matsuura E., Igarashi Y.. Fujimoto M. et al. Heterogeneity of anticardiolipin antibodies defined by the anticardiolipin cofactor. J.Immunol., 1992,148,3885-3891

32. Oosting J.D., Derkscn R.H.W.M.,Bobbin K.I.W. el al. Anliphospholipid antibodies directed against a combination of phospholipids with prothrombin, protein C or protein S: an explanation for their pathogenic mechanism? Blood, 1993. 81. 2618-2625

33. Sugi T., McIntyre J.A. Auioantibodies to phos-phaiidyleihanolamine (PE) recognize a kininogen-PE complex. Blood. 1995, 86, 3083-3089

34. Alarcon-Segovia D., Deleze M., Oria C.V. et al. Anliphospholipid antibodies and the anliphospholipid syndrome in systemic lupus erythematosus. A prospective analysis of 500 consecutive patients. Medicine, 1989, 68, 353-365

35. Couchock S., Fort J., Munoz S. et al. False positive ELISA

tests for anticardiolipin antibodies in sera from patients with repited abortious, rheumaiologic disorders and primary biliary cirrosis: correlation with elevated polyclonal IgM and implications for patients witch repeated abortion. Clin. Exp. Immunol., 1998,73,289-294

36. Adopian M.S.. Boctor F.N., Peter J.B. el al. False-positive test result for IgM anticardiolipin antibody due to IgM rheumatoid factor. Arthr.Rheum., 1988,31,1212-1213

37. Hasselaar P., Triplett D.A., La Rue A. et al. Heat treatment of serum and plasma induces false positive results in the antiphospholipid antibody ELISA. J.Rheumatol., 1990,17,186-191

38. Cabiedes J., Cabral A.R., Alarcon-Segovia D. Hidden antiphospholipid antibodies in normal human sera circulate as immune complexes whose antigen can be removed by heat. acid, hipermolar buffer* or phospholipasc treatment. EurJ.Rheumatol, 1998,28,2108-2114

39. Malsuda J., Sailon N.. Gohchi K. et al. Distinguising B2-glycoprotein I dependent (systemic lupus erithematosus type) and independent (syphilis type) anticardiolipin antibody witch tween 20. Br.J.Haematol., 1993,85,799-802

40. Arvieux J., Roussel B. Influence of Tween 20 on the detec-

tion of B2-glycoprotein 1 - dependent anticardiolipin antibodies. Br.J.Haematol., 1994,87,443-444

41. Cabral A.R., Cabiedes J., Alarcon-Segovia D. Tween-20 detaches cardiolipin from ELISA plates and maker ^nticar-diolipin antibodies undetectable regardless of the presence of B2-glycoprotein I. J.Immunol.Methods.,1994,175,107-114

42. Hunt J.E., McNeil H.B., Morgan G.J. et al. A phospholipid-B2-glycoprotein I complex is an antigen for anticardiolipin antibodies occurring in autoimmune disease but not with infection. Lupus, 1992, 1, 75-81

43. Roubey R.A. Antigenic specifities of antiphospholipid antibodies implications for clinical laboratory testing and diagnosis of the antiphospholipid syndrome. Lupus, 1996,5,425430

44. McCarthy J.M., wagenknecht D.R., McIntyre J.A. Activity of antiphospholipid antibody ELISA cofactor in different animal sera. J.Clin.Lab.Anal., 1994,8,167-171

45. Arvieux J., Darnige L., Hachulla E.et al. Species specificity of anti-B2 glycoprotein I autoantibodies and its relevance to anticardiolipin antibody quantitation. Thromb.Haemost., 1996,75,725-730

46. Matsuura E., Igarashi Y., Yasuda T., Triplett D., Koike T.

Anticardiolipin antibodies recognize beta 2-glycoprotein 1 structure altered by interacting with an oxygen modiffed solid phase surface. J.Exp.Med.,1994,179,457-462

47. Hunt J., Krilis S. The fifth domain of beta2-glycoprotein I containes a phosphilipid binding site (cys281 -cys288), and region recognised by anticardiolipin antibodies. J.Immunol., 1994,152, 653-659

48. OhKura N., Magihara Y., Yoshimura T. et al. Plasmin can reduse the function of human B2 glycoprotein I by clearity domain V into a nicked form. Blood,1998.91,4173-4179

49. Roubey R.A.S.. Eisenberg R.A., Harper M.F. et al. "Anticardiolipin" autoantibodies recognize B2-glycoprolein I in the absence of phospholipid. Importance of antigen density and bivalent binding. J.Immunol., 1995,154,954960

50. Arvieux J., Rcgnault V., Hachulla E. et al. Heterogeneity and immunochemical properties of anti-beta 2 -glycoprotein I autoantibodies. Tromb.Haemost., 1998,80,393-398

51. Koike Т., Matsuura E. Anti-B2 -glycoprotein I antibodie: specificity and clinical significance. Lupus, 1996,5,378-380

52. Sheng Y„ Kandiah D.A., Krilis S.A. et al. Anli-B2 -glycoprotein I antibodies from patients with the "antiphospholipid" syndrome bind to B2-giycoprotein I witch low affinity dimcrization of B2-glycoprotein I induces a significant increase in anti- B2-glycoprotein I antibody affinity. J.Immunol., 1998,161,2038-2043

Поступила 10.09.04